Платинова Буковина

История открытия и развития метода полимеразной реакции (ПЦР)1985     

Кэри Муллис из корпорации Cetus впервые опубликовал в журнале Science статью об открытии ПЦР.

1989   

Достовірні аналізи :  Буковинська ДНК-лабораторія

Термостабильная ДНК-полимераза, Taq, (сделавшая возможной автоматизацию ПЦР) объявлена журналом Science молекулой года.

Hoffmann-La Roche Inc. и Cetus приняли решение начать разработку применения ПЦР в диагностических целях.

1990   

Ученые Cetus, D. Gelfand и S. Stoffel названы выдающимися изобретателями очищенной Taq DNA-полимеразы.

Внедрен первый диагностический набор для применения в судебной экспертизе (определение HLA DQA).

Ученые Cetus, H. Erlich и K. Mullis удостоены награды в области биохимического анализа Немецким Обществом Клинической Химии.

1991   

Первая публикация Cetus по методу TaqMan.

Hoffmann-La Roche Inc. получила отCetus права и патенты на использование ПЦР

Основывается Roche Molecular Systems, занимающийся исключительно проблемами развития PCR.

Разработана RT-PCR, что сделало возможным обнаружение РНК-содержащих вирусов.

Первая публикация ученых Cetus о термостабильной обратной транскриптазе.

Ученый Cetus, H. Erlich, удостоен награды Интернациональной Федерации Клинической Химии.

1992   

Внедрены первые стандартизованные тест-системы для клинической ПЦР-диагностики AMPLICOR Chlamidia trachomatis и AMPLICOR HIV-1.

1993   

Внедрен первый стандартизованный набор для PCR-диагностики РНК – AMPLICOR HCV.

Kary Mullis получил Нобелевскую премию в области химии за предложение концепции PCR.

Начато производство AMPLICOR© C. trachomatis

1995   

Начато серийное производство COBAS AMPLICORTM- первой автоматизированной системы для ПЦР-диагностики и первых стандартизованных диагностических наборов для проведения количественных определений AMPLICOR HIV-1 MONITORTM и AMPLICOR HCV MONITORTM.

1996   

Начато серийное производство тест-систем AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis AMPLICOR Enterovirus*, AMPLICOR HCV MONITORTM

1997   

Начато серийное производство анализатора COBAS AMPLICORTM

1998   

Начато серийное производство тест-систем COBAS AMPLICOR MONITORTM

1999   

В Американских банках крови внедрены тесты для гепатита С и HIV

2000   

Национальный Институт по Изучению Генома Человека выделил 1,2 млн долларов на разработку программы по расшифровке генотипа при помощи термоциклеровой технологии Рош

2001   

Roche Diagnostics выдан патент США на волоконно оптическое устройство для приложения к «real-time» ПЦР.

2002   

COBAS TaqMan анализатор получил одобрение FDA-это этап в развитии автоматизации ПЦР

 

 

Все началось в 1983 году с идеи Кэри Мюллиса, который работал ученым биохимиком в компании Cetus в Калифорнии. Скромно он заметил, что серия удачных совпадений привела к открытию этого метода.

 

Метод ПЦР был встречен как один из наиболее важных методов молекулярной биологии. За это революционное открытие Доктор Мюллис получил Нобелевскую премию в области химии. В 1990 году Roche Molecular Systems приобрела права на ПЦР. Нашей целью было в первую очередь разработать стандартизованную систему, затем автоматизировать разные этапы ПЦР, превращая тем самым метод ПЦР в рутинный метод как для исследований, так и для клинической диагностики. Амплификация первых тест-систем Amplicor проводились термоциклерах РЕ 2400 и 9600. Учет результатов проводился в планшетах с использованием автоматических вошера и ридера. Вероятность контаминаций снижена благодаря включению фермента AmpErase (Урацил-N-гликозилазы) в ПЦР смесь, способствующей избирательному разрушению продуктов, перенесенных из предыдущих продуктов амплификации. В 1995 году запущен в производство автоматический анализатор COBAS AMPLICOR

первая полностью автоматизированная система амплификации и учета результатов

система второго поколения для качественного и количественного анализа

первая система в развивающейся серии автоматизированных систем

в настоящее время в мире около 4000 приборов

 

С автоматизацией ПЦР все большее число лабораторий начали проводить ПЦР. «Доморощенные» системы были трудоемкими не стандартизированными, требовали подготовки большого числа реагентов и не были   воспроизводимыми. AmpErase не применялся, что приводило к частой контаминации ампликонами во многих лабораториях.

 

После разработки COBAS AMPLICOR остался один неавтоматизированный процесс-подготовка пробы. До постановки ПЦР необходимо выделить нуклеиновую кислоту из бактерии или вируса. Подготовка образца трудоемкий процесс. Ручной труд при обработке пробы составляет приблизительно 70% стоимости тестирования.. С 2001 года стало возможным контролировать подготовку образца. Автоматический анализатор COBAS AmpliPrep является полностью автоматизированной системой для подготовки образца перед постановкой ПЦР в COBAS AMPLICOR. Действия руками ограничены загрузкой и выгрузкой образцов, что сводит к минимуму ошибки, связанные с обработкой образца вручную и защищает оператора от воздействия вредных веществ.

 

Автоматизация NAT находится на начальном этапе развития и является одной из немногих областей в лабораторной диагностике, полагающихся на ручные методы и полуавтоматические приборы. Основным требованием потребителя является упрощение постановки ПЦР за счет уменьшения этапов работы, работы руками. Все это способствует более быстрому получению результата теста, что необходимо для более эффективной терапии пациента. Повышение продуктивности является ключевой целью клинических лабораторий, но это возможно только при наличии систем, позволяющих уменьшить количество действий, занимающих много времени, таких как подготовка инструментов, работа руками и эксплуатация. Полная автоматизация подразумевает освобождение оператора для выполнения других заданий.

 

Продолжающаяся работа системы позволяет проводить перестановку образцов. Может быть запущен анализ даже небольшого числа образцов с последующим добавлением образцов при работающей системе.

 

Другим ключевым требованием является поддержание достоверности результатов. Репутация лаборатории основывается на качестве выдаваемых ею результатов, и автоматизация приводит к снижению числа ошибок, связанных с ручной подготовкой и тестированием проб.

 

Как анализатор COBAS AMPLICOR так и анализатор COBAS AmpliPrep контролируются Amplilink software, в котором используется графический  интерфейс Windows NT, что обеспечивает быстрый и легкий доступ к системе. Система может быть связана с информационной системой лаборатории (LIS) с помощью двустороннего интерфейса.

 

Amplilink software обладает уникальным свойством, которого лишены  другие аналогичные системы. Образцы могут отслеживаться с помощью кодировки, связанной с исходной пробиркой, на всем протяжении от подготовки в COBAS AmpliPrep до результатов, полученных в COBAS AMPLICOR.

 

COBAS AmpliPrep выделяет РНК/ДНК мишени для ПЦР с применением жидкофазного зонда носителя. Известное число молекул РНК внутреннего контроля (IC) или стандарта количественного определения (QS) вносится в каждый образец вместе с лизирующим реагентом и меченым биотином зондом. После лизирования вирусного капсида РНК или ДНК мишень вместе с IC или QS гибридизуется со специфичным мишени зондом, меченым биотином. Гибридный комплекс РНК связывается магнитными частицами, покрытыми стрептавидином. Этот комплекс затем осаждается и промывается, растворяется и переносится в новую пробирку, которая запечатывается и возвращается в исходную позицию в штативе для образцов.

 

В ходе данного автоматизированного процесса РНК или ДНК выделяется из капсида, очищается от ингибиторов ПЦР и концентрируется для повышения чувствительности тестирования.

 

Обработанная проба, содержащая покрытые стрептавидином магнитные частицы, связанные с РНК-мишенью и IC/ QS, добавляется в ПЦР смесь для последующей амплификации.

 

Все реагенты в COBAS AmpliPrep находятся в готовом к применению виде в кассетах, что позволяет экономить время подготовки реагентов и избежать ошибки, возможной при ручной подготовке. Емкости с реагентом в кассетах имеют самозакрывающийся механизм, сводящий к минимуму испарение и повышающий стабильность реагентов. Закодированная на кассете информация автоматически считывается сканером после ввода штатива в систему, что позволяет быстро и четко вводить данные о количестве образцов, дате, лоте и т.д. В COBAS AmpliPrep используются штативы для образцов сходные с применяемыми в Integra 400 и Cobas Core.

 

Одним из основных препятствий, которые должен преодолеть производитель приборов при работе с инфекционными заболеваниями, является контаминация. Учитывая это компания Рош много вложила в разработку постоянных и одноразовых элементов для сведения к минимуму возможность ошибки. В добавление к разработке прибора, Рош повышает качество результата с помощью технологии-носителя с зондом, использования контроля выделения и амперазы.

 

Были продемонстрированы данные, свидетельствующие о хорошей корреляции между ручной пробоподготовкой и автоматической подготовкой проб при помощи COBAS AmpliPrep. Были продемонстрированы данные, свидетельствующие о хорошей корреляции между ручной пробоподготовкой и автоматической подготовкой проб при помощи AmpliPrep (рисунок 1).

 

 

 

Рисунок 1. Корреляция между автоматической системы пробоподготовки COBAS AmpliPrep и ручными методами AMPLICOR подготовки

 

После внедрения анализатора Cobas Amplicor в 1995г. ПЦР стала стандартизированным, рутинным, простым в применении диагностическим инструментом, приносящим выгоду клиническим лабораториям благодаря повышению чувствительности, надежности, и быстрой диагностике и мониторингу инфекционных заболеваний. Теперь сочетание системы Cobas AmpliPrep и анализатора Cobas Amplicor сделало ПЦР действительно простым процессом, повысив продуктивность и сделав максимальной точность результатов - таким образом соответствуя требованиям быстрого точного тестирования и повышая качество работы вашей лаборатории.